将暗场显微镜与高光谱成像相结合的研究方法可有效研究组织、活细胞或溶液中的纳米材料。超连续光源和高光谱成像滤波器，可将显微镜转变为高光谱暗场成像系统，涵盖可见光和近红外光范围。这种高光谱暗场成像系统在纳米材料研究中具有潜在应用，利用暗场高光谱显微镜揭示透明、未染色样品（如聚合物、晶体和活细胞）上的纳米颗粒特性，无需繁琐的样品准备，对于改进基于纳米等离子体的成像和疾病检测具有重要意义。
金纳米颗粒的高光谱暗场特性研究：鉴别与定位
将暗场显微镜与高光谱成像相结合，提供了一种高效的方式来研究组织、活细胞或溶液中的纳米材料。从等离子体和其他纳米结构的散射光中获得的信息，有助于我们了解它们的成分、尺寸和分布情况。
Photon etc.公司提供两种不同的高光谱暗场成像平台：可调谐激光源（TLS）和IMA，前者允许在激发下进行滤波，后者提供发射滤波
TLS由两个模块组成：超连续谱源（宽带源）和基于Photon等的体积布拉格光栅（VBG）技术的激光线可调谐滤波器（LLTF-带通滤波器）。IMA由同样基于VBG的高光谱成像滤光片（超立方体）组成。当与配备暗场聚光镜的研究级显微镜结合使用时，TLS和超立方体可以将该显微镜转换为高光谱暗场设置。这些系统可在可见光（400-1000nm）、近红外（900-1620nm）或两者（400-1620nm）光谱范围内连续调谐。这一套平台能够在无需繁琐的样品准备的情况下，深入研究纳米材料的性质。
一、使用TLS获得的结果
在Patskovsky等人[1]的这项研究中，使用高光谱暗场成像研究了靶向CD44+阳性人类乳腺癌细胞的金等离子体纳米颗粒（AuNPs）。这套系统已成功用于在固定的细胞制备中执行CD44靶向AuNPs的三维光谱定位和光谱鉴定（见图1）。这种空间和光谱信息对于改进基于纳米等离子体的成像、疾病检测和在复杂生物环境中的治疗至关重要。
图1、使用100倍物镜沿光学z轴在不同平面拍摄的暗场图像。焦平面位于（a）玻璃基底表面（S点）或（b）人类乳腺癌细胞的顶部表面或细胞内部（C点）[1]。
与华盛顿大学的David Ginger教授合作，使用Photon etc.公司的高光谱暗场成像仪对100纳米的AuNPs进行了研究。从432nm到849nm以3nm的步长获取了散射数据。图2（a）和（b）显示了高光谱结果和从数据中提取的典型散射光谱（c）。波长的变化有助于确定颗粒的大小，空间信息有助于评估颗粒的分布。
图2、（a）从高光谱数据中提取的576nm暗场图像；（b）放大了提取光谱的区域；（c）提取的散射光谱。
二、使用IMA获得的结果
在蒙特利尔理工学院Michel Meunier教授的研究小组的研究中，IMA被用于研究用AuNPs标记的人类乳腺癌细胞。
Photon etc.的高通量高光谱滤波器允许快速获取光谱分辨率高的图像。由于相机捕捉到视场内的整个图像，因此可以实时收集信息并跟踪细胞和发光的纳米尺度组分的动态。Photon etc.的PHySpec™软件允许进行主成分分析（PCA），以便在样品中识别和定位纳米颗粒。
Photon etc.公司的高光谱滤光片其高通量的特性，可快速获取光谱分辨率高的图像。由于相机捕捉的是视场中的整个图像，因此可以实时收集信息并跟踪细胞和发光纳米级组件的动态。Photon etc.公司的软件PHySpec™可进行主成分分析(PCA)，以识别和定位样品中的纳米颗粒。
图3（a）呈现了使用60x物镜拍摄的，标记有60nm AuNPs的MDA-MB-23人类乳腺癌细胞的暗场图像。在400nm到650nm的范围内，以2nm的步长和2s的曝光时间进行成像，面积为150 x 112μm2。几分钟内，获取了一百多万个光谱，每个光谱都覆盖了整个可见光范围。
细胞通常具有平坦的散射光谱，而AuNPs在约550nm处显示出尖锐的峰值。图3（b）展示了从乳腺癌的暗场高光谱立方体中提取的550nm图像。经过PCA软件处理后，金纳米颗粒被标记为绿色。乳腺癌细胞的放大图（图3c)和包含AuNPs的区域的光谱（图3d)证实了60nm纳米颗粒的存在。
图3、（a）标有AuNps（60nm尺寸）的人类乳腺癌细胞的暗场图像，（b）550nm的单色图像，经过PCA后标记为绿色的AuNPs，（c）乳腺癌细胞的放大图，（d）不同区域中AuNPs的散射光谱（请参见（c）中相应的箭头）。
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相关文献：
[1] Patskovsky, S., Bergeron, E., & Meunier, M. (2013). Hyperspectral darkfield microscopy of PEGylated gold nanoparticles targeting CD44-expressing cancer cells. Journal of Biophotonics, 8(1–2), 162–167.
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