Refine激光器——高灵敏度频率调制CARS 具有紧凑和快速可调谐的光纤光源

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Refine激光器——高灵敏度频率调制CARS 具有紧凑和快速可调谐的光纤光源

相干反斯托克斯拉曼散射 

显微镜已成为一种强大的技术，具有许多在生物医学成像、细胞生物学和医学领域的应用。如果泵浦源和斯托克斯场，分别以频率ω_p和ω_s与拉曼活性分子相互作用,以并且频率Ω=ω_p-ω_s发生共振，产生频率为ω_AS=2ω_p-ω_s的谐振反斯托克斯信号。这个信号允许对未染色样品进行化学选择性成像。然而，这个信号也有不包含任何特定的化学信息的非共振信号的贡献。这种非共振背景强度取决于采样，非共振信号会使共振信号失真，甚至可以淹没谐振信号 。共振和非共振CARS响应起源于来自三阶磁化率。

在外向方向上检测 CARS信号显着降低了非共振型号的贡献，因此提高了检测灵敏度。尽管如此，许多可以避免或消除CARS中的非共振背景的替代技术出现了，例如，偏振敏感检测 ，和时间分辨CARS，当时这也导致了信号衰弱和采集时间的延长。宽带技术，例如多重 CARS  (M-CARS )，允许重建原始拉曼线形 ,具有积分时间长的缺点，不适合高速成像应用。干涉CARS提供足够的成像速度和灵敏度 ，但会受到样本的图像伪影导致折射率变化的影响。此外，共振和非共振图像的数字减影是预发送并允许获取背景校正图像 。作为替代获取背景校正的CARS 型号的技术 ，频率调制FM CARS   出现了。在 FM CARS 中，谐振和非谐振贡献CARS  信号由两个波长交替的泵浦脉冲和一个固定在波中的斯托克斯脉冲测量长度。锁定放大器 (LIA) 检测然后用于谐振之间的即时差异计算以及两个交替泵浦波的开关频率下的非共振 CARS  信号。因此，FM CARS  允许以增强的灵敏度高速采集背景校正的 CARS  信号。基于不同固态光源组合的FM CARS的首次实验实现提供调频泵场和斯托克斯场。尽管如此，结合这些可测量低至 0.05% 的光源浓度值，约为两个数量级数量级优于标准CARS 。后来，FM CARS 使用来自单个的啁啾激光脉冲Ti:sapphire 激光器的出现，已经降低了光源的复杂性，但在CH-stretch 中的调谐速度和调谐范围或指纹区。然而FM CARS 自由空间光源维护的复杂性和高要求不允许专业激光实验室外的常规应用。

为了克服上述限制，我们实现了一种紧凑、快速和广泛可调的基于光纤的光源为 FM CARS 提供所有必要的脉冲。使用这种光源，拉曼共振700 cm^-1和 3200 cm^-1之间的波长可通过波长调谐在仅5ms内对任意波进行寻址，并启用具有帧到帧波长切换的高灵敏度 FM CARS 测量。这种 FM 功能基于光纤，因此可以无缝集成到全光纤 FOPO 灯中来源 。我们使用 FM CARS 进行浓度测量，与标准 CARS  显微镜。此外，FM CARS 成像和具有增强的双色 FM CARS 成像显示对比度。由于整个光源基于光纤，因此实现了紧凑而坚固的光源。这一发展构成了推进相干拉曼成像在便携性和医疗诊断或环境传感应用的灵敏度。实现了由掺镱（Yb 3+）光纤振荡器和FOPO组成的全光纤光源（图一)，它提供了波长可调的同步皮秒脉冲，用于相干拉曼测量。它提供了三个而不是两个不同波长的脉冲，即斯托克斯脉冲以及波长交替泵浦脉冲，对于后来的 FM CARS 实验是必需的。产生的斯托克斯脉冲在振荡器内并用可饱和吸收镜 (SAM) 锁模，可在波长（WL 滤波器）在 1020 nm 和 1060 nm 之间，持续时间为 7 ps，并被放大（前置放大器和Amp) 分两级，在光隔离器 (Iso) 后面的输出处达到 400 mW。波长滤波器由一个基于光栅和紧凑型机电光束偏转的定制光纤耦合滤波器开关时间为 300 µs，比大约 5 ms 的 FOPO 启动快得多。

品质因数为M²= 1.16±0.07和相对强度噪声 (RIN) 是在 20.25 MHz，-153.5dBc/Hz 的条件下测量的。除了斯托克斯脉冲之外，在带有线性谐振器的FOPO中还产生了 7ps长的泵浦脉冲，其基于50厘米的polarization-maintaining (PM) 光子晶体光纤（PCF、NKT Photonics、LMA-PM-5）以及在定制的 FM 模块和输出端抛光 FC/PC 连接器，反射率约为 4%。PCF 用于生成参数四波混频 (FWM) 增益可通过波长调谐在750nm和980nm 之间进行波长调谐仅5ms内的振荡器（相应的波长调谐曲线可以在参考文献的图 3（a）中找到。）。FOPO 和放大的振荡器脉冲的组合用作 CARS  的泵浦和斯托克斯波，并允许处理 700 cm^-1和 3200 cm^-1之间的拉曼谱带。FOPO 谐振器中的 SMF完成了光谱窄色散调谐 ，使得反馈信号脉冲在时间上被拉长，并且只有窄光谱部分 (<12 cm^-1) 与下一个要放大的泵浦脉冲重叠。因此，谐振器的光路长度直接与 FOPO 输出的波长相关。自定义——在 FOPO 和振荡器之间制作啁啾光纤布拉格光栅 (CFBG) 用于匹配重复对于所有振荡器波长，振荡器的频率与 FOPO 的重复率之比，并取代了自由空间其他 FOPO 中使用的光延迟线  保持振荡器和 FOPO 同步。对于输出FOPO 测量到光束质量因子M²= 1.03±0.03 和 -127.5 dBc/Hz 的RIN

对于 FM CARS 测量，反馈机制进行了修改，如蓝色框（FM模块，图1) 原则上形成两个光学分离的 FOPO 谐振器，其中每隔一个脉冲被馈送通过不同的路径返回。为此，FOPO 的光纤耦合端镜被替换为参考的常规设置。由一个由光纤耦合电光调制器 (EOM) 组成的模块，一个光纤耦合偏振分束器 (PBS) 和两个端镜（M1 和 M2）。EOM 已同步到40.5 MHz 振荡器重复率的一半，这导致两个反射镜 M1 之间的脉冲到脉冲切换和 M2，分别。由于 PBS 和 M1 之间的光路长度与PBS 和 M2 形成了两个不同光路长度的线性谐振腔，这是由于FOPO 输出脉冲的两个交替中心波长的色散调谐。

FOPO 的脉冲到脉冲波长切换示例性地显示为固定斯托克斯波长1032.7 nm (图2（一个））。844.9 nm (2152 cm^-1 ) 和 846.9 nm (2124 cm^-1 )之间的波长切换通过光栅分离FOPO输出的波长并测量两个用两个光电探测器在空间中分离的脉冲序列。由此产生的时间轨迹验证了清晰的脉冲到脉冲波长交替。

除了时间分布之外，FOPO 在 845nm 附近的光谱输出是使用光学仪器测量的。频谱分析仪（图2(b))，而斯托克斯脉冲保持在 1032.7nm 波长的中心。这波——长度组合可以访问氘代样品的光谱区域，例如氘代二甲基亚砜(dDMSO)。用于自发 FWM 增益区域内的波长微调（图2 中的黑色曲线）(b))调整了反射镜 M1 和 M2 提供的反馈的光路长度差。光谱高以红色和蓝色点亮，相距 28 cm -1并代表图2 中测得的脉冲序列（一个）。在这配置，反射镜 M2 是光纤集成和固定的，实现 FOPO 以固定波数发射在固定振荡器波长的增益带宽（红色曲线）的右侧。而 M1 被放置在自由空间光延迟线，通过其位置精确调整 FWM 增益区域中的第二个波长（灰色曲线）。为了覆盖整个自发 FWM 增益带宽，反射镜 M1 必须移动 5.6 cm，而图 2(b) 中红色和蓝色光谱的谐振器长度差异仅为 0.8 cm 并且保持不变测量时固定。因此，如果脉冲在输出是可以接受的，自由空间光延迟线可以用完全集成的光纤反射镜代替。

所有的 CARS  测量都是使用自制的激光扫描显微镜向前进行的带有显微镜物镜 (Seiwa PEIR-Plan-50x, NA = 0.6) 和光电倍增管 (PMT, HamamatsuH7422-20) 无需解扫描。PMT 信号用 LIA (Zurich Instruments HF2LI) 在调制频率为 20.25 MHz。对于 FM CARS 测量，使用了如图1所示的 FOPO ，而对于标准 CARS 测量，M1 的反馈路径被机械快门阻挡。为了量化 FM CARS 与标准检测灵敏度相比所实现的增加测量了含有 dDMSO 和水的 CARS 稀释系列。对于该测量，dDMSO 的共振在2125 cm^-1和大约 2145cm^-1处的非共振贡献以相同的平均功率处理在成像平面中大约 20 mW。对于此特定测量，LIA 检测带宽设置为 1 Hz用于降低噪声以提高灵敏度。标准CARS信号以及 FM CARS 信号均被归一化为纯 dDMSO的信号并针对浓度作图（图3）。为了验证 FM CARS 的好处，我们调查了低浓度低于 10% 的交易量。使用标准 CARS ，水中的 dDMSO 浓度约为 2%测量，受非共振背景的限制。对于 FM CARS ，检测限约为 0.05 %。dDMSO在水中（添加了红色和蓝色虚线以引导眼睛），因此灵敏度提高了40 的因数。由于残留的电子噪声，甚至无法分辨更低的浓度。调频CARS 结果与方程非常吻合。其中 Ganikhanov 等人介绍低浓度下FM CARS强度的表达式。

使用 FM CARS 测得的水中浓度限制约为 0.05% dDMSO甲醇水溶液。然而，代替使用同步固态激光器，这里展示的结果是通过使用单个紧凑而坚固的光源实现的，这是一个重要的简化并实现 FM CARS 在专业激光实验室内外的常规应用。为了展示所提出的用于成像应用的光源的能力，首先是一个技术样本，即使用标准 CARS 和 FM CARS 对 dDMSO 和菜籽油的混合物进行成像以进行直接比较（图4(a) 和 (b))。调制泵浦脉冲的波长为 841.4 nm 和 840.5 nm，寻址结合 1038nm 的斯托克斯脉冲、dDMSO 在 2250cm^-1的弱拉曼共振和分别在 2263 cm^-1处的非共振贡献。被调查的菜籽油仅表现出非共振CARS 信号，因为菜籽油在两个波数下都没有表现出任何拉曼共振。在焦平面上，两个泵浦脉冲串的平均功率为 32 mW，而斯托克斯脉冲串的平均功率为60 兆瓦。图4中显示的所有图像（512x512 像素，无平均）都是在 LIA带宽为1MHz 以证明调频 FOPO 非常适合快速成像，尽管 LIA较低带宽将进一步降低电子噪声。如图4 所示(a)、强非共振CARS 信号来自菜籽油（下部）是可测量的，而在图4(b) 区域内的 FM CARS信号菜籽油显示接近零的非共振信号，因此具有更高的对比度。对比度被量化通过从图4 中的图像中划分非共振和共振信号的平均值(a) 和 (b) 和在标准 CARS图像 2.5 中，而在 FM CARS中为 45.0。因此，18 倍对比度增强和显着提高了可区分性。为了演示获取背景抑制图像的 FM CARS 功能拉曼光谱中的不同共振，菜籽油中的聚苯乙烯 (PS) 珠粒（图4）(c) 和 (d)) 和新鲜用 dDMSO 浸泡两小时的脂肪组织（图4(e) 和 (f)) 成像。PS珠子被成像解决 1035 cm -1处的指纹共振。在这个特定的样本中，一个因子的对比度增强7.2 被确定。一般来说，可实现的对比度增强取决于共振的强度以及非共振 CARS 的贡献，并且因不同的拉曼共振和样品而异。斯坦-dardCARS（图4(e)) 和 FM CARS （图4）(f)) 获取组织的图像以解决分子dDMSO 在 2125 cm -1处的振动（在 2D 颜色图的垂直轴上从黑色到绿色）和脂质在2850 cm -1（在 2D 颜色图的水平轴上从黑色到洋红色）。在标准 CARS  图像中脂质的强烈非共振贡献降低了对比度，导致图4 中的白色区域(e)因为绿色和洋红色加起来为白色（二维颜色图的对角线）。FM CARS 启用重新成像导致脂质的非共振贡献，因此，绿色和洋红色区域在空间上变得很好在图4中的假彩色图像中分离（F）。对于所有 FM CARS 图像，非共振 CARS 贡献在波数比上述拉曼共振波数高出大约 20 cm -1处测量。在图4 中的图像旁边，我们将可视化 1附加到补充材料中，它显示了实时使用标准和 FM CARS 在四帧处对新鲜脂肪组织中的 dDMSO 和脂质共振成像每秒（256x256 像素，无平均），但是，具有帧到帧波长切换。尤其是这测量强调了这里介绍的光源的好处，因为可以在两个拉曼共振时间小于 5 ms 结合对比FM CARS  的增强。

总之，一种用于 FM CARS 的坚固、紧凑、快速且广泛可调的基于光纤的光源被提出。光源由快速可调锁模光纤振荡器、两级放大器和一种适用于 FM CARS   的光纤参量振荡器，带有用于波长交替的光纤模块调制频率为 20.25 MHz。结合斯托克斯脉冲，背景抑制调频CARS 成像是在一个简单的锁定放大器 (LIA) 检测方案中完成的。允许使用 FM CARS 用于在 1 Hz 的 LIA 带宽下检测低至 0.05 % 的浓度，代表了改进与标准 CARS  相比，灵敏度提高了 40 倍。在 1 MHz 的 LIA 带宽下，减少CARS  信号的非共振贡献，因此，增加的检测灵敏度导致对比度增强 18 倍，即使在快速成像应用中也能提高图像质量。结合光源在 5ms 内的快速和宽波长可调性，FM CARS 与完成了帧到帧的波长切换。未来，所呈现灯的 FM 功能源也可用于精确测量两个相邻拉曼共振随时间的比值50 ns 的分辨率，通过参考一个拉曼共振对第二个拉曼共振，例如可以在肿瘤诊断领域找到应用。此外，紧凑的光纤集成和实现的稳健性不仅可以在专门的激光实验室内进行 FM CARS 成像，还可以提供有可能用于医疗诊断或环境传感。

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