用于亚纳米聚焦和单分子成像的激光直写

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用于亚纳米聚焦和单分子成像的激光直写

技术背景：

单分子显微镜极大地扩展了我们对细胞环境中蛋白质复合物的结构组织、功能构象(functional conformations)和动力学的了解。近来的研究在提高其空间分辨率 、穿透深度、活细胞成像能力和单分子成像方法上取得了显著进展。

具有高空间分辨率的单分子成像方法都采用轴向聚焦锁定(如全内反射模式的红外激光)和横向校正方法(如荧光标记)的组合。以高准确度(~1nm)执行的实时三维聚焦锁定将来自单个荧光事件的光子收集z大化，并且与没有主动稳定的标准方法相比，定位精度提高了>10 倍。不准确或缓慢的主动校正会导致漂移，降低定位精度并显著降低原位分辨率(即使在过滤或分组等分析后处理之后也是如此)。

通过结合光学捕获和优化单个发射器的x/y位置和宽度 (z)，已将具有纳米精度的实时聚焦锁定应用于体外样品。与细胞成像兼容的新发展依赖于基准点(fiducial)的随机沉积(deposition)或明场图像中样品本身的透射轮廓。然而，当在距离盖玻片>5µm的深度进行成像时，这些方法在商用轴向聚焦锁定(通常具有约20nm精度，即Nikon Perfect Focus)上都没有显示出明显的改善，且横向补偿有限(如果有的话)。因此，尽管荧光成像技术有望实现高定位精度并增加穿透深度，但它们对三维成像的一般适应性仍然有限。因此，非常需要一种具有活细胞兼容性、跨微米范围的绝对三维定位以及精度优于任何先前报道的单分子方法的photon-limited定位精度的聚焦方法。

技术要点：

基于此，澳大利亚新南威尔士大学的Simao Coelho(一作兼通讯)通过使用双光子激光直写来控制样品中基准点的位置和三维结构来解决这些聚焦限制，从而在细胞体积的所有维度上实现实时亚纳米聚焦(<0.8nm)。并通过整个细胞体积内的三维单分子采集和以纳米精度进行活细胞单粒子追踪证明方法的有效性。

图 1：基准制造和三维聚焦锁定示意。a.双光子激光直写。NIR飞秒激光用于触发引起光敏材料聚合的化学反应。非线性激发固化焦点处的光敏树脂，而其它区域不受影响。b.三维聚焦锁定。在明场照明下，基准点产生干涉图案(下)，该干涉图案被独立的相机以高帧率记录。衍射图案的变化用于监测样品所经历的运动。

实验结果：

图2：用于3D dSTORM成像、无监督数据采集和活细胞单分子跟踪的定制基准

实时亚纳米聚焦和动态聚焦

参考文献：Coelho, S., Baek, J., Walsh, J. et al. Direct-laser writing for subnanometer focusing and single-molecule imaging. Nat Commun 13, 647 (2022).

DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-022-28219-6

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