长期以来，光学显微镜的分辨率都被认为是有极限的，它不可能超过二分之一个光波长度。荧光显微成像是一类对特定样本使用荧光蛋白或分子标记后对其标记物成像的光学显微成像技术。而超分辨率荧光显微成像系统由于其可以实现纳米级的成像分辨率，且对样品破坏性小，可进行三维成像，可进行活体样品观测等特点，在近十几年来受到生命科学、显微成像、计算机等等领域科学家的广泛关注，并促使了一系列适合生物样品成像的超分辨率成像技术的开发与应用。
超分辨荧光显微成像技术
单分子定位荧光显微成像包括光激活定位显微（PALM）和随机光学重构显微（STORM）。两者的原理相似，成像过程均需要往复循环，在每个循环周期里，荧光分子团被连续的激活、成像及漂白。
PALM工作原理
光激活定位显微技术photoactivated localization microscopy（PALM）其基本原理是首先使用光活化绿色荧光蛋白（PA-GFP）来标记蛋白质，并将较低光功率的405nm 激光照射细胞表面，用于激活稀疏分布的几个荧光分子。之后用561nm激光照射，使已经激活的荧光分子因为受激发射而产生荧光信号，接着继续照射使这些发光的荧光分子产生漂白， 在下一轮不能被激发光再次激活。之后交替使用405nm和561nm激光来进行激活，激发和漂白其他的荧光分子。往复循环，直至全部完成稀疏标记的细胞成像。图1展示了使用光激活定位显微技术PALM 定位单个荧光分子最后实现超光学衍射极限分辨率成像的示意图。PALM的成像方法只能观察基于细胞外源表达的蛋白质。
图1.PALM超分辨率显微成像系统原理及示意图
PALM超分辨系统系统部分组成及光路结构：
（1）倒置荧光显微镜：可以用于激光扫描共焦显微成像或者单分子PALM显微成像。（2）半导体激光：405nm激光器作为激活光，561nm激光器作为激发光，激光器波长的选择是要和使用的光活化蛋白的特性有关，用于激发荧光的激光器波长一般包括488、561、594、635nm。激光器功率一般在50-200mW。为了光路调节的方便，一般要求激光器输出光斑质量要好。（3）自由空间或光纤多波长耦合器：自由空间耦合器可以使得更高功率的激发和激活激光进入显微镜系统，使得成像过程可以更快。（4）快门或AOTF(Acousto-Optic Tunable filter声光可调滤波器)：快门或AOTF的作用是切换激活光和激发光，使得激活光和激发光依次照射在样品上，实现快速光开关的目的。在空间光输入到显微镜之前，使用AOTF可以使得进入显微镜的光强最大。（5）激发滤光片、二向色片、长通滤光片：用于收集荧光信号最大，同时阻挡激发光，使得保证信噪比，消除残余光和自发荧光。（6）TIRFM(全内反射荧光显微镜)物镜。TIRFM物镜的作用是使光束在样品表面发生全内反射，用以提高图像的信噪比。同时TIRF物镜的数值孔径都比较大，会有比较好的光子收集效率。（7）emccd或scmos相机。相机要在可见光范围内有较高的量子效率、较高的帧速、较低的噪声。
图2. PALM成像效果
蛋白的激活和漂白通常需要多种窄线宽激光器。法国Oxxius激光器生产厂商则提供了这样的合束激光器解决方案，专门为生物视觉领域设计。
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