拉曼效应是由C.V.拉曼在20世纪20年代发现。它是一种广泛使用的光谱方法来确定分子的振动模式。与其他分析化学方法相比，光谱方法提供了高空间分辨率。不需要直接接触就可以获得化学信息。振动光谱提供了合理的化学特异性，而不需要额外的标签。然而，自发拉曼效应是一个弱散射过程。对于成像和显微镜的应用来说，获得一个视场可能需要几个小时的信号整合时间。因此，相干拉曼散射方法，如刺激拉曼散射效应，现在被广泛用于拉曼成像。在这个应用说明中，我们将描述Moku:Lab的锁相放大器是如何在波士顿大学的刺激拉曼成像装置中实现的。
拉曼效应是由C.V.拉曼在20世纪20年代发现。它是一种广泛使用的光谱方法来确定分子的振动模式。与其他分析化学方法相比，光谱方法提供了高空间分辨率。不需要直接接触就可以获得化学信息。振动光谱提供了合理的化学特异性，而不需要额外的标签。然而，自发拉曼效应是一个弱散射过程。对于成像和显微镜的应用来说，获得一个视场可能需要几个小时的信号整合时间。因此，相干拉曼散射方法，如刺激拉曼散射效应，现在被广泛用于拉曼成像。在这个应用说明中，我们将描述Moku:Lab的锁相放大器是如何在波士顿大学的刺激拉曼成像装置中实现的。
介绍
拉曼光谱是一种非破坏性的分析化学技术。它直接探测样品的振动模式。与电子光谱法相比，拉曼光谱法提供了高化学特异性，而不需要荧光标签。样品可以以完全无接触和无标签的方式被询问，防止对系统的破话。红外（IR）光谱是另一种常用的获得振动光谱的方法。红外光谱和拉曼光谱的选择规则是不同的；红外光谱对偶极子的变化很敏感，而拉曼光谱对偏振性的变化很敏感。这使得红外和拉曼成为一组特定化学键的良好工具。对于成像和显微镜的应用，在选择红外或拉曼光谱时，还有两个重要因素需要考虑。1）空间分辨率要求。红外光谱法使用红外光作为光源。拉曼可以使用可见光或近红外（NIR）激光器进行激发。由于可见或近红外激光器的波长更短，拉曼显微镜的空间分辨率可以达到亚微米级。另一方面，红外光的波长为几微米。对于许多显微镜的应用来说，其空间分辨率被认为是很差的。2）水在红外区域有强烈的吸收。对于富含水的环境（如生物样品），红外光会受到强烈的背景吸收。因此，在某些情况下，拉曼是不错的选择。
与占主导地位的瑞利散射相比，拉曼散射非常弱。为了获得合理的信噪比，通常需要几秒钟的长积分时间。这对于常规光谱学来说可能不是问题，但对于光谱成像来说，可能需要几个小时才能得到一个视野。为了增强信号，多年来已经开发了几种不同的方法。基于质子的方法，如表面增强拉曼光谱，进一步降低检测极限到单分子水平。相反，纳米颗粒的诱导不均匀性使其难以成像。对于成像科学家来说，更有前途的方法是非线性光学增强的相干拉曼散射方法：刺激拉曼散射（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）。
相干拉曼效应发现于20世纪60年代6。在20世纪90年代末和21世纪，由于超快锁模激光器的进步，Sunney Xie和他的同事们率先将CARS9和SRS10用于无标签化学显微镜。从那时起，这些技术已被广泛用于化学、生物学和材料科学研究。 CARS和SRS有很多相似之处；这些非线性光学过程通常发生在相同的条件下，仪器设置也几乎相同。然而，也有一些不同之处；就像自发拉曼一样，CARS信号（图1，ωas反斯托克斯）与进入的激光束（ωp，泵浦，ωs斯托克斯）相比，发生在不同的波长。用短通滤波器很容易将信号与入射光分开。到达检测器的光子总量很小，更敏感的光子检测器，如光电倍增管（PMTs）被用来检测。然而，CARS受到由其他非共振非线性光学效应产生的背景的影响。这些效应不仅限制了CARS测量的实际检测极限，而且还扭曲了光谱（与分子振动共振相比）。另一方面，SRS信号不受大多数其他非线性光学效应的干扰。然而，SRS是一个受刺激的发射过程。信号发生在与入射光线相同的波长上。SRS效应只是稍微增加/减少了斯托克斯和泵浦光束的光子数量，分别。这些变化是如此之小，以至于无法用常规的时域测量方法来测量。因此，SRS需要有锁定检测的光学泵探技术。
泵-探针法是一种广泛采用的检测多光子过程的方法。该实验通常涉及两个超快（皮秒或飞秒）激光束。一束激光始终照亮样品，而第②束激光则以恒定的频率进行调幅调制。因此，由第②束激光引起的任何变化或扰动都会以调制频率转移到第①束激光上。在检测器上，一个光学滤波器被用来阻挡调制光束。只有未调制的波长被检测到。由于信号只发生在调制频率附近，通常使用锁相放大器（LIA）来放大信号。 锁定放大器使用同调检测方法，它将输入的信号与调制频率的正弦局部振荡器混合。然后它将信号通过一个低通滤波器和电压放大器（可选），输出到数字转换器或示波器。这确保只有非常接近调制频率的信号被放大和检测。其他频率的信号（如激光重复频率或直流背景）被拒绝。这使得锁相放大器成为泵浦探针检测的重要工具。关于锁相放大器更详细的解释可以在以下视频中找到：https://youtu.be/H2O2ADqEkHM 和 https://youtu.be/M0Q91_ns2Cg。
特别是对于SRS来说，两束光（泵和斯托克斯）被调谐成与感兴趣的拉曼位移精确匹配的能量差。在理论上，泵浦或斯托克斯光束都可以被调制，而另一光束则用于检测。如果泵浦光束被调制，在泵浦光束开启的情况下，SRS过程会引起斯托克斯光束的轻微增加。在检测器上，泵浦光束被阻断，只有斯托克斯光束被检测到。这就是所谓的刺激拉曼增益（SRG）检测。如果斯托克斯光束被调制，在斯托克斯光束开启的情况下，SRS过程会引起泵浦光束的轻微下降。在检测器上，斯托克斯光束被阻断，只有泵浦光束被检测到。这被称为刺激性拉曼损失（SRL）检测。对于本应用说明中提出的使用案例，由于光电探测器针对泵的波长进行了优化，因此实施了SRL方案。
SRS的产生需要两个超快的激光脉冲在样品上重叠，包括空间和时间上的重叠。为了获得稳定的时间重叠，今天的SRS显微镜通常使用一个Ti:Sapphire激光器来产生泵浦和斯托克斯光束。皮秒和飞秒激光器都可用于SRS测量。皮秒激光器提供更精细的光谱轮廓。不需要额外的光学器件就可以实现高光谱分辨率。与自发拉曼不同的是，所有的拉曼位移都可以用单色激光器同时测量，而刺激拉曼需要调谐波长来测量更多的光谱点，而且在获取光谱图像时，调谐激光波长会限制测量的速率。另一方面，飞秒激光器本身具有宽广的光谱。一种叫做 "光谱聚焦 "的技术可以用来快速调整泵浦和斯托克斯光束之间的能量差。可以在更短的时间内获得光谱图像。然而，这种方法也大大增加了系统的光学复杂性。一对衍射光栅或高折射率材料（如SF57玻璃棒）需要被添加到光束路径中，而且光谱范围是有限的。关于光谱聚焦方法的详细解释可以在近期的一份出版物中找到。
简而言之，如果一次只对单个拉曼位移感兴趣，皮秒激光器的设置要简单得多。飞秒激光器是快速获取高光谱图像的不错选择，其代价是系统的复杂性。Moku:Lab LIA可以与皮秒和飞秒激光器配对。在本应用说明中介绍的使用案例中，飞秒激光器（Spectra-physics Mai Tai）与SF57玻璃棒一起用于光谱聚焦。
泵和斯托克斯光束通常由声光调制器（AOM）或电光调制器（EOM）进行调制。调制频率通常在MHz范围内。这有助于减少光热膨胀产生的背景，提高图像采集速度。在本应用说明中，泵浦光束被AOM调制在2MHz左右。
为了使泵浦和斯托克斯光束在时间上保持一致，一个电动延迟台被用来调整其中一个或两个光束路径的长度。对于带有光谱聚焦的飞秒SRS，延迟台也被用来微调泵浦和斯托克斯光束之间的能量差。
像大多数其他非线性光学显微镜一样，光束扫描方法通常用于CARS和SRS图像的采集。一对振镜-振镜或振镜-共振扫描头被放置在物镜前。在本案例中，使用了一对振镜（GVS 102, Thorlabs）。
在扫描头之后，光束被引导到物镜上，在样品上形成一个紧密聚焦的点。为了建立相干拉曼散射的相位匹配条件，可以使用高数值孔径（NA）的水浸或油浸物镜。然后，光在前向被收集并重新聚焦到光电探测器上。为了确保收集效率，建议使用油浸式物镜。在本案例中，使用了一个60X 1.2 NA的水浸式物镜（UPLSASP 60XW，奥林巴斯）。
一旦光线被聚光器收集，在经过光学过滤器阻挡调制光束后，它就被重新聚焦到光电二极管上。来自光电二极管的信号然后被送到锁相放大器（根据光电二极管的配置，可能需要一个前置放大器/跨阻抗放大器）。锁相放大器将信号与本地振荡器混合，并将调制频率的交流信号转换为直流输出。然后，它被送到数据采集系统，形成图像。在这个应用中，Hamamatsu S3994-01与一个自制的跨阻抗放大器配对使用，用于检测光学过滤器后的剩余光线。然后，信号被送到Moku:Lab的LIA进行交流信号的放大和对话。输入是用外部（PLL）模式解调的。在混频器之后使用了一个7μs的二阶低通滤波器。解调后的信号经过10dB增益后被送到模拟输出。LIA的输出被NI DAQ系统数字化，图像由一个自制的NI虚拟仪器生成。
为了测试Moku:Lab的LIA性能，将一滴二甲亚砜（DMSO）夹在两片盖玻片之间。然后用SRS显微镜对液滴的边缘进行成像。在扫描头之前，激光器被调谐为798纳米泵浦（30毫瓦）和1040纳米斯托克斯（150毫瓦）。在整个光谱范围内，总共获得了100张图像。LIA的时间常数被设定为7μs。图4显示了液滴边缘的X-Y剖面图，右边是Z剖面图（拉曼光谱）。可以清楚地观察到由C-H键振动共振引起的两个主要峰值。
为了获取图像的信噪比（SNR），使用较亮的图像（2930 cm-1附近）。信噪比是由液滴区10乘10方框的平均强度超过背景区10乘10方框的标准偏差来计算的。观察到的信噪比为1100。
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