发生Bleedthrough和crosstalk的原因是在荧光显微镜中经常被混淆的两个问题，当然这两种现象本身也不宜分清，本文对这两者进行解释，方便对症下药解决问题。
Bleedthrough还是Crosstalk，这是一个问题
以下三张放大40倍图片是FITC标记的肌动蛋白和Cy3标记线粒体，并使用Lumencor SPECTRA X八通道LED显微镜光源对两种荧光染料进行激发，用于显示Bleedthrough和crosstalk的不同表现以及不同的解决方案。
图1.SPECTRA X 光引擎
青色光通道激发，485/25滤光片，Semrock LED-DA/FI/ TR/Cy5-4X 四带通多边分束器和发射滤光片
在这幅图像中同时存在bleedthrough和crosstalk现象。Bleedthrough表现为图像中细胞外灰度相对较高(对比图2，已消除bleedthrough的情况)。
图2.SPECTRA X 光引擎
青色光通道激发，475/28滤光片，Semrock LED-DA/FI/ TR/Cy5-4X 四带通多边分束器和发射滤光片
通过改变激发滤光片的通带，使其不与多边发射滤光片的通带相交，从而消除了bleedthrough。Bleedthrough的原因是激发光通过发射滤光片传输到相机。通过检测细胞核周围的线粒体荧光，本图像中仍然存在crosstalk(与图3相比，图3消除了crosstalk，产生肌动蛋白的特异性图像)。
图3.SPECTRA X 光引擎
青色光通道激发，475/28滤光片，Semrock 单带通FITC二向色镜和发射滤光片
从根本上说，crosstalk是由于荧光团(如FITC和Cy3)的激发和发射光谱的波长范围有所交集。即使Cy3荧光团是较合适被绿色(~550 nm)光激发，它同样也能被青色(475 nm)光激发到足够的程度，在图2中很容易被检测到。通过将四带通多边分束器和发射滤光片改为单带通二向色镜和发射滤光片来消除crosstalk信号，从而在检测系统的发射侧实现了更精确的阻挡。这种解决方案是一种妥协，因为它以速度为代价提高了分辨率。
当然在荧光成像时，我们需要尽可能的去减小bleedthrough以及crosstalk的影响
选择荧光染料时，应尽量选择发射光谱带宽较窄的
同时使用多种荧光染料时，应尽量选择光谱间没有重叠的，以免产生信号串扰，或者也可适当降低某几种荧光染料的浓度。如下图中DyLight 405，FITC以及Texas Red三种荧光染料，发生光谱间几乎没有重叠，以他们进行三种颜色标记时发生的串色效应就会很小。
荧光团激发和发射光谱必须与系统的光源和滤光片组特性相匹配
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