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灵活的同时介观尺度高速神经活动双光子成像

发布时间:2022-04-14 14:46:54 浏览量:3146 作者:LY.Young 光学前沿

摘要

为了了解大脑作为一个整体如何处理信息和执行行为,有必要以细胞级分辨率监测整个大脑的神经元活动模式。具有钙指示剂的双光子显微镜已成为神经科学中用于对清醒行为动物的神经元群进行功能性在体成像的标准工具。最近,新的双光子显微镜的发展使得能够对大脑不同区域中越来越多的神经元进行成像。这是通过定制光学元件的设计和制造实现的,这些元件支持在数毫米的视野范围内成像,同时保持细胞级分辨率。然而,当前使用单焦点激发的扫描策略需要在成像区域的数量和整体采集速率之间进行权衡。高达~10Hz的总帧速率已经能够实现,但是这个帧率限制了可以研究的神经元动力学类型。像扫动(whisking)、嗅探(sniffing)、眼球运动(eye movements)和运动(locomotion)这样的感觉运动(sensorimotor)行为与持续的神经活动关联,并以4-12Hz的数量级激发。钙瞬变的解卷积可以将尖峰(spike)事件的时间精度提高到<100毫秒。因此,要将这些估计的尖峰与行为联系起来,采样率需要处于足够的奈奎斯特频率(>30 Hz)。使用多焦点激发的并行扫描可以在高扫描速度下实现真正的同时多区域成像。目前,大视场多焦点双光子显微镜通常设计为具有固定光束分布,以匹配空间排列的检测方案。这限制了用户在整个视场中检测特定感兴趣的神经元群的能力,并限制了由于光散射的空间串扰而在增加的深度上解析荧光的能力。

正文


灵活的同时介观尺度高速神经活动双光子成像


技术背

为了了解大脑作为一个整体如何处理信息和执行行为,有必要以细胞级分辨率监测整个大脑的神经元活动模式。具有钙指示剂的双光子显微镜已成为神经科学中用于对清醒行为动物的神经元群进行功能性在体成像的标准工具。最近,新的双光子显微镜的发展使得能够对大脑不同区域中越来越多的神经元进行成像。这是通过定制光学元件的设计和制造实现的,这些元件支持在数毫米的视野范围内成像,同时保持细胞级分辨率。然而,当前使用单焦点激发的扫描策略需要在成像区域的数量和整体采集速率之间进行权衡。高达~10Hz的总帧速率已经能够实现,但是这个帧率限制了可以研究的神经元动力学类型。像扫动(whisking)、嗅探(sniffing)、眼球运动(eye movements)和运动(locomotion)这样的感觉运动(sensorimotor)行为与持续的神经活动关联,并以4-12Hz的数量级激发。钙瞬变的解卷积可以将尖峰(spike)事件的时间精度提高到<100毫秒。因此,要将这些估计的尖峰与行为联系起来,采样率需要处于足够的奈奎斯特频率(>30 Hz)。使用多焦点激发的并行扫描可以在高扫描速度下实现真正的同时多区域成像。目前,大视场多焦点双光子显微镜通常设计为具有固定光束分布,以匹配空间排列的检测方案。这限制了用户在整个视场中检测特定感兴趣的神经元群的能力,并限制了由于光散射的空间串扰而在增加的深度上解析荧光的能力。


技术要点:
基于此,美国波士顿大学的Mitchell Clough(一作)和Jerry L. Chen(通讯)提出了一种四区域大视场双光子显微镜(quad-area large FOV two-photon microscope, Quadroscope),能够在横跨约5mm的总视场上实现四个可独立靶向大脑区域的视场同时视频帧率细胞级分辨率成像。作者展示了其在行为相关时间尺度上测量小鼠感觉运动皮层钙活性的能力。
(1) 使用两个独立扫描引擎实现跨大视场同时成像,两个扫描引擎使用相似的物镜和相似的光学组件,结合自适应光学实现双区域成像的分辨率增强。
(2) 引入基于焦平面单元(focal plane units, FPU)的光束组合,实现成像视场数的增加。



a、Quadroscope系统。激光源由flip mounted mirror(FM)选择。激光输出随后被50/50分束镜分成四束(光束1-红色,2-橙色,3-绿色,4-蓝色)。每一束光相对于另一束延迟8ns,经过扩束镜(BE)后进入焦平面单元(focal plane units, FPUs)。1/2波片结合偏振分光镜(PBS)实现每束光能量的控制。两个扫描引擎各自控制两个成像预取。每一个扫描引擎由三个商业扫描镜头(SL1-3)、一个共振扫描仪(resonance scanner)、一个二维扫描反射镜、一个定制的扫描镜头(SL4)至于合束PBS之前组成。合束的光进入一个定制的tube lens,随后进入定制的物镜(OBJ)。一个长通二向色镜(IR/VIS dichroic)用于分离激发光和发射光。b、FPU设计。每一个FPU安装在一个机械XY位移台上,包含一个电动可调镜头(electrically tunable lens, ETL)和一个中继镜头。c、扫描区域定位示意图。四个子区的每一个能扫描的区域达~0.75平方毫米。每一个扫描臂有3mm的臂视场,在这个臂视场范围内,可以使用FPU来重新定位子区域。臂视场可以用二维扫描反射镜在4.8mm的总视场内任意定位。d、覆盖在小鼠皮层图谱上的扫描区域和视场。e、四波束的时空复用。一个31.25MHz的激光源被分成四束并实现8ns脉冲间隔延迟。探测到的荧光信号随后被解复用并分配到每个成像区域。


实验结果:

使用1040nm激光源对清醒小鼠感觉运动皮层中 jYCaMP1s的四区双光子钙成像


附录:


Quadroscope系统机械设计


定制扫描镜头和tube lens说明


探测系统的光学设计和分析


参考文献:Clough, M., Chen, I.A., Park, SW. et al. Flexible simultaneous mesoscale two-photon imaging of neural activity at high speeds. Nat Commun 12, 6638 (2021).
DOI:https://doi.org/10.1038/s41467-021-26737-3


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